摘要：紫草素是一种天然存在于紫草科植物中的萘醌衍生物，是药用植物紫草的主要活性成分。在此之前，我们从培养的紫草细胞中鉴定了一种细胞色素P加氧酶(CYP)CYP76B74，它可以催化香叶基氢醌(GHQ)的3"-羟基化反应，香叶基氢醌是紫草素生物合成的关键中间体。在本研究中，我们使用RNA测序技术对来自紫草的不同组织（红根和绿叶/茎）进行了转录组分析。将在根中发现的CYP高表达基因在酿酒酵母中进行异种表达，并以GHQ为底物进行功能筛选。结果，表征了催化GHQ氧化的CYP76B亚家族的两个CYP。CYP76B催化GHQ的香叶基侧链，使其在C-3"位置羟基化形成3"-羟基香叶基氢醌(GHQ-3"-OH)。酶CYP76B在C-3"位置进行GHQ的氧化反应，产生GHQ的3"-羧酸衍生物(GHQ-3"-COOH)以及GHQ-3"-OH。本文首次阐述了以GHQ为底物的酶催化氧化反应。本研究表明CYP76B和CYP76B在紫草素生物合成中具有潜在的作用。

杂志名：Phytochemistry()

英文题目：PotentialroleoftwocytochromePsobtainedfromLithospermumerythrorhizonincatalyzingtheoxidationofgeranylhydroquinoneduringShikoninbiosynthesis

作者：WanSong,YibinZhuang,TaoLiu

单位：中国科学院天津工业生物技术研究所，中国科学院系统微生物生物技术重点实验室，中国科学院大学，北京，

紫草素及其衍生物是紫草根组织中的天然萘醌类衍生物，具有多种生物活性。紫草素的合成途径为莽草酸途径和甲羟戊酸途径(图1)。从紫草悬浮培养物中鉴定了一种细胞色素P单加氧酶(CYP)，它催化GHQ形成关键中间体GHQ-3"-OH。紫草素生物合成的第一个单加氧酶CYP76B74已经被克隆并从紫草中鉴定出来，该酶催化了关键3"-羟基化反应。通过中间体GHQ-3"-CHO提出了一种可能的环闭合机制，其可以通过亲电反应与芳核形成碳碳键(图1)。

图1：紫草素的生物合成途径。

单箭头为一步反应，双箭头为多步反应，虚线箭头为未定义步骤或酶还未被验证。红色酶反应是CYP76B和CYP76B将GHQ转化为GHQ-3"-OH或GHQ-3"-COOH。

图2：CYP76B催化的GHQ生物合成产物的LC-MS分析。

(A)GHQ标准品HPLC色谱图(黑线)，只表达AtCPR1的对照酵母菌株提取物(绿线)，共表达CYP76B和AtCPR1的酵母菌提取物(红线)，波峰对应GHQ-3"-OH(1)。(B)CYP76B催化GHQ氧化为GHQ-3"-OH(1)。(C)21.1min洗脱产物1的质谱。

图3：CYP76B催化GHQ合成产物的LC-MS分析。

(A)GHQ标品HPLC图谱(黑线)，只表达AtCPR1的对照酵母菌提取物(绿线)，CYP76B与AtCPR1共表达的工程酵母菌提取物(蓝线)。波峰对应GHQ-3"-OH(2)、GHQ-3-COOH(3)。(B)CYP76B催化GHQ生成GHQ-3"-OH(2)，可能中间产物GHQ-3"-CHO，最后是GHQ-3"-COOH(3)。(C)21.1min洗脱产物2的质谱。(D)21.6min洗脱产物3的质谱。

培养含有pCf-AtCPR1-CYP76B或pCf-AtCPR1-CYP76B的酿酒酵母BY菌株，与GHQ一起培养以进行大规模发酵，以分离足够氧化产物CYP76B和CYP76B用于化学结构表征。新产物经提纯后提交核磁共振分析。纯化产物1和2的1H-NMR和13C-NMR谱数据(表1)与之前报道的GHQ-3"-OH的1H-NMR和13C-NMR谱数据完全吻合。

表1产物2和产物3的1H和13C的核磁共振光谱数据(CD3OD，，MHz，δppm)

从工程菌株中分离微粒体蛋白，以GHQ为底物，对含有CYP76B或cyp76b的微粒体进行酶解分析，验证CYP76B和CYP76B的GHQ羟基化活性。与阴性对照相比，酶转化产物的HPLC保留时间与饲养实验产生的GHQ-3"-OH和GHQ-3"-COOH相同(图4)。结果表明，CYP76B催化GHQ的3"-羟基化形成GHQ-3"-OH，CYP76B催化GHQ氧化生成GHQ-3"-COOH。

图4：HPLC法测定CYP76B和CYP76B与GHQ体外培养的微粒体酶。

仅含AtCPR1的微粒体为阴性对照(黑线)。共表达CYP76B和AtCPR1的工程酵母菌株中提取的微粒体酶(绿线)，共表达CYP76B和AtCPR1的工程酵母菌株制备微粒体酶(蓝线)。

为说明CYP76B、CYP76B和CYP76家族之间的进化关系，利用全长氨基酸序列构建系统发育分析。紫草科的3个CYP：CYP76B、CYP76B和CYP76B74都表现出典型的细胞色素P特征(图5)。CYP76B和CYP76B氨基酸与已报道的植物CYP76B亚家族CYP序列进行序列比对，同源性显著。

图5：香叶基氢醌3"-加氧酶的多个氨基酸序列比对

总结：我们从差异表达的基因中研究了红根中转录上调的候选CYP基因，在酵母菌中CYPs的异源表达和体外酶学分析均表明，CYP76B和CYP76B催化GHQ的C-3"位置氧化为羟基或羧基，对新产物进行分离，并用核磁共振谱鉴定了氧化产物的化学结构。在本研究中，我们报道了催化GHQC-3"位置氧化的两个CYP的鉴定，这可能为紫草素的生物合成提供更多的见解。